Site Meter АНТИОКСИДАНТНОЕ И ИММУНОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА ЛИЧИНОК ВОСКОВОЙ МОЛИ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ У КРЫС, ВЫЗВАННОМ ПОТРЕБЛЕНИЕМ КОРМА, ОБОГАЩЕННОГО ЖЕЛЕЗОМ

АНТИОКСИДАНТНОЕ И ИММУНОПРОТЕКТОРНОЕ ДЕЙСТВИЕ ЭКСТРАКТА ЛИЧИНОК ВОСКОВОЙ МОЛИ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ У КРЫС, ВЫЗВАННОМ ПОТРЕБЛЕНИЕМ КОРМА, ОБОГАЩЕННОГО ЖЕЛЕЗОМ


А.А. ОВСЕПЯН, Н.И. ВЕНЕДИКТОВА, М. В. ЗАХАРЧЕНКО, Р.Е. КАЗАКОВ,
М.Н. КОНДРАШОВА, Е.Г. ЛИТВИНОВА, И.Р. СААКЯН, Т.В. СИРОТА, И.Г. СТАВРОВСКАЯ, П.М. ШВАРЦБУРД

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН
E-mail: litvinova@rambler.ru, mkondrashova23@inbox.ru, тел.: 7(4967)33-05-53


 Резюме: Антиоксидантное и иммунопротекторное действие экстракта личинок восковой моли Galleria mellonella - биологически активной добавки, разработанной нами на основе старинного противо-туберкулезного средства народной медицины, исследовалось на модели окислительного стресса, вызван-ного пищевой перегрузкой железом. Длительное потребление крысами корма, обогащенного железом в дозах, близких к принятым в ветеринарии, приводило к развитию окислительного стресса и нарушениям иммунных и митохондриальных функций. Одновременное с железом добавление экстракта устраняло или существенно снижало окислительный стресс и патологические изменения, вызванные длительным потреблением железа.

Наряду с созданием новых высокоэффективных синтетических лекарств накапливаются данные о неблагоприятных побочных действиях при их применении, что заставляет обратиться к немедикамен-тозным природным лечебным средствам, которые, к сожалению, становятся уже мало известными. Од-ним из таких очень важных для медицины средств является экстракт личинок большой восковой моли, использовавшейся в народной медицине при лечении туберкулеза. Биологические исследования препа-рата проводили Мечников, его ученики и некоторые другие. Особенно большой вклад в клиническое изучение препарата внес крупный московский кардиолог и врач широкого профиля С.А. Мухин. Помимо успешного применения препарата для лечения туберкулеза он открыл его лечебное действие при сердеч-ных заболеваниях и общеукрепляющее действие на лиц пожилого возраста. В личном контакте С.А.Мухина и М.Н. Кондрашовой начались исследования в нашей лаборатории механизмов биологиче-ского действия препарата, который при поддержке ОАО ДИОД мы разрабатываем в качестве БАД, названной в знак уважения к С.А. Мухину – Натуральный экстракт доктора Мухина. Разработанный пре-парат защищен патентом и имеет разрешение на применение.
Это остро востребованное средство не находит до сих пор широкого применения из-за недоста-точных знаний механизмов его действия. Ранее мы показали, что спиртовой экстракт личинок восковой моли (ЭВМ) улучшает состояние туберкулезных больных и людей с ослабленным иммунитетом [1–4].
МДА в гомогенатах печени, эритроцитах, митохондриях мозга и сердца определяли спетрофото-метрически по реакции с тиобарбитуровой кислотой [11].
АОА гемолизатов цельной крови и эритроцитов определяли по измерению степени ингибирования аутоокисления адреналина в щелочном (рН 10,6) карбонатном буфере. Образование продукта окиления – адренохрома регистрировали на спектрофотометре UVIKON 923 при 347 нм как описано Сирота Т.В. (2000).
Структурное и функциональное состояние митохондрий исследовали разработанным нами мето-дом [12]. Размер ансамблей митохондрий и эндоплазматического ретикулума в гомогенатах тканей опре-деляли путем компьютерной видеомикроскопии. 30 мкл гомогената добавляли к 970 мкл среды гомоге-низации (125 мМ KCl, 10 mM HEPES), перемешивали в течение 5 минут при разных температурах (18 и 28ºС) и помещали в камеру Горяева. Ансамбли исследовали микроскипией в темном поле и изображения фиксировали с помощью видеокамеры. Для каждого препарата проводили морфометрический анализ девяти случайно выбранных полей зрения, содержащих около 2000 объектов.
Дыхание митохондрий исследовали полярографически, используя термостатируемую полярогра-фическую ячейку с компьютерной регистрацией и обработкой полярограмм. Измерения проводили при 26 и 37ºС для митохондрий сердца и мозга, соответственно. Скорость дыхания вычисляли по снижению содержания кислорода в ячейке в 1 мин на 1 мг митохондриального белка
Для определения фагоцитарной активности нейтрофилов использовали реакционную смесь сле-дующего состава: гепарин 0,8 мкл; кровь 20 мкл; 0,2% нитросиний тетразолий 20 мкл; Смесь наносили на предметное стекло и добавляли 10 мкл 0,1% липополисахарида из Salmonella typhimurium. После пе-ремешивания каплю смеси термостатировали в течение 30 минут при 37ºС во влажной камере. Каплю смывали 0,15 М фосфатным буфером (рН 7,2), готовили прижизненный препарат, и число фагоцитиру-ющих нейтрофилов в площади препарата определяли, регистрируя клетки, содержащие гранулы форма-зана.
Количество генерируемой митохондриями перекиси водорода определяли в присутствии сукцина-та и антимицина А [13]. Количество перекиси определяли при 25ºС по интенсивности хемилюминесцен-ции люминола в присутствии пероксидазы хрена при 425 нм. Митохондрии сердца (0,5 мг белка) добав-ляли к 1 мил среды, содержащей 120 mM KCl, 10 mM HEPES (pH 7.4), 0.5 mM EDTA, 12,5 мкМ люмино-ла и 1,1 единиц пероксдазы. Концентрацию перекиси выражали в нмоль/мин/мг белка
Белок определяли по Лоури. Статистический анализ результатов проводили с использованием критерия Стьюдента
Результаты.
В табл. 1 представлен вес животных в конце эксперимента и данные исследования органов.
Таблица 1

Увеличение было особенно высоким (в 1,9 раз) в митохондриях мозга. В эритроцитах прием желе-за по-разному влиял на перекисное окисление липидов у животных разных возрастов: у взрослый живот-ных увеличивал, у растущих – снижал уровень МДА. Это различие свидетельствует, что у растущих жи-вотных добавка железа расходуется на поддержание основного пути его утилизации – на формирование эритроцитов, снижая тем самым повреждающее действие железа на клетки и предотвращая окислитель-ное повреждение. У взрослых животных образование эритроцитов не столь интенсивно и перегрузка клеток железом и их окислительное повреждение более выражены, чем у растущих животных. Прием ЭВМ приводил к снижению МДА в обеих группах по сравнению с контролем. Это свидетельствует об антиоксидантном действии препарата. Развитие окислительного стресса, вызванного приемом железа, сопровождалось изменениями со стороны системы антиоксидантной защиты. У растущих животных АОА крови на фоне приема железа повышался, а ЭВМ нормализовал уровень АОА крови (рис. 1). По-вышение АОА крови на фоне приема железа, у молодых животных, вероятно, является компенсаторной реакцией в ответ на повышение скорости генерации активных форм кислорода под действием приема железа и свидетельствует о напряжении системы антиоксидантной защиты организма. ЭВМ нормализу-ет уровень АОА крови, что, по-видимому, является следствием ослабления давления окислительного стресса на систему антиоксидантной защиты. У взрослых животных прием железа снижал уровень АОА крови и экстракт восковой моли не предотвращал это снижение (данные не представлены). Это свиде-тельствует о более выраженном окислительном повреждении у взрослых животных. На фоне приема железа происходила изменение параметров дыхания митохондрий, что проявлялось в гиперактивации дыхания на сукцинате в митохондриях сердца и снижении скорости дыхания в мозге у животных, полу-чавших железо (рис. 2А). Прием ЭВМ предотвращал изменение дыхания в митохондриях.

Митохондрии являются одними из основных источников супероксида и перекиси водорода в клетке. Генерация этих активных форм кислорода в значительной степени зависит от скорости дыхания: увеличение скорости дыхания приводит к снижению генерации H2O2 [13–15]. Образование перекиси мы исследовали на митохондриях сердца, где низкий уровень каталазы.
Как и ожидалось, скорость образования перекиси в митохондриях сердца с гиперактивированным дыханием (в группе, получавшей железо) была ниже, чем в контроле (рис 2Б). Однако, хотя ЭВМ приводил к снижению скорости дыхания митохондрий крыс, получавших железо, это не приводило к увели-чению генерации H2O2. Это может быть проявлением антиоксидантной активности Экстракта  Восковой Моли, которая предотвращает избыточную продукцию перекиси, вызванную снижением скорости дыхания. По-видимому, это связано со способностью ЭВМ уничтожать супероксидный анион-радикал – предшественник перекиси.
Ранее нами был разработан тест, позволяющий оценивать состояние митохондрий, который вклю-чает измерение способности митохондрий в гомогенате образовывать комплексы - ансамбли с участием эндоплазматического ретикулума. Этот тест является очень чувствительным к физиологическому состо-янию организма [12]. Разрушение ансамблей свидетельствует о повреждении митохондрий. Размер ан-самблей митохондрий печени взрослых крыс, получавших железо, снижался на 30%. Одновременный прием ЭВМ предотвращал вызванное железом разрушение ансамблей (табл. 3). У растущих животных прием железа не приводил к изменению размера митохондриальных ансамблей, что свидетельствует об отсутствии нарушений в структурном взаимодействии митохондрий и эндоплазматического ретикулума.
Таблица 3

В процессах фагоцитоза повреждающее действие железа и защитный эффект ЭВМ были особенно ярко выражены. У взрослых животных длительное включение железа в рацион приводило к значительному ингибированию иммунной активности полиморфноядерных лейкоцитов, что проявлялось по снижению способности к адгезии, уменьшению диаметра клеток и фагоцитарной активности после стимуляции липополисахаридом из Salmonella typhimurium (рис. 3А). У принимавших железо животных способность нейтрофилов к адгезии снижалась на 75%, диаметр активированных клеток – на 50%, число клеток с включенными гранулами НСТ снижалось на 90%. Включение ЭВМ в рацион животных, получавших
железо, в значительной степени предотвращало по всем показателям вызванные железом нарушения. Нарушения со стороны иммунной системы, вызванные железом, проявлялись также морфологическими изменениями другой иммунной ткани – тимуса, где наблюдались дряблость, точечные кровоизлияния,очаги некроза. У взрослых крыс эти изменения были более выраженными и наблюдались практически увсех животных (рис 3Б). Прием ЭВМ примерно втрое сокращал повреждения тимуса, как у взрослых, таки у растущих крыс.
Рис.

Проведенные исследования показали, что продолжительное включение в пищу добавки железа в низких лечебных дозах может приводить к патологическим нарушениям, степень тяжести которых корреллирует с уровнем индуцированного железом окислительного стресса. У растущих животных повреждения менее выражены, чем у взрослых животных. Окислительный стресс проявлялся увеличением уровня МДА в тканях и приводил к увеличению или снижению антиоксидантной активности крови (в зависимости от тяжести окислительного стресса). На рис. 4 видно, что вес тела и содержание МДА связаны обратной зависимостью в обеих экспериментальных группах. Чем успешнее проходило формирование организма, тем меньшее количество МДА содержалось в эритроцитах. Рис.4


ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Известно, что многие заболевания сопровождаются развитием окислительного стресса и наруше-нием обмена железа. Последнее, как правило, приводит к снижению иммунитета. Мы обнаружили, что Экстракт Восковой Моли защищает иммунные клетки (белой крови и тимуса) от повреждения при развитии окислительного стресса in vivo, вызванного длительным приемом пищи, обогащенной железом. Кроме того, Экстракт Восковой Моли предотвращает развитие окислительного стресса в тканях и сохраняет структурную и функциональную активность митохондрий, особенно сердца. Согласно современным представлениям антиоксиданты эф-фективны и при лечении патологий сердца. Выявленная нами способность улучшать функциональное состояние митохондрий сердца, а также продемонстрированная ранее способность увеличивать уровень гликогена и снижать ацидоз в сердечной мышце подтверждает данные С.А.Мухина о лечебном действии препарата при сердечных заболеваниях и показывает механизмы этого действия.
Вероятно, антиоксидантная активность, продемонстрированная нами in vivo, а также иммунопро-текторные свойства препарата лежат и в основе его противотуберкулезного действия. Проведенные нами исследования позволяют надеяться, что Экстракт Восковой Моли может быть использован в терапии заболеваний, патогенез которых первично обусловлен нарушением реутилизации железа - атаксии Фридриха, β-талассемии, последствия гемодиализа, для снижения побочных эффектов антибиотиков, для профилактики инфекционных и респираторных заболеваний.

Для лечения большинства упомянутых патологий применяют синтетические лекарственные средства с побочным действием. Особенно токсичны противотуберкулезные препараты новых поколений. Использование нетоксичного немедикаментозного природного препарата, поддерживающего иммунную систему человека, является весьма актуальным.
 

Литература
1. Litvinova E.G. et al. // Mitochondrion. 2002. Vol.1. P.523
2. Ovsepyan A.A. et al. // Young doctors on the threshold of the third millennium, materials of the confer-ence. Yerevan, 2001. P.103
3. Дмитриева Н.В. и др. // Апитерапия сегодня. Рыбное, 1993. С.59
4. Гусак Ю.К. и др.// Проблемы эндокринологии в акушерстве и гинекологии. Москва, 1997. С.146
5. Rachkov A.K. et al. // J. Pharm. Pharmacol. 1994. Vol. 46, №3. P.221-225
6. Спиридонов Н.А. и др. // Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хо-зяйстве. Пущино, 1996. С.187-195
7. Spiridonov N.A. et al. // Comp. Biochem. Physiol (С). 1992. Vol.102. P.205-208
8. Сирота Т.В. и др. // Биоантиоксидант. Тезисы 6-й международной конференции. Москва, 2002. С.528-530
9. Пат. 2038086 РФ. Способ получения биологически активного продукта из личинок большой восковой моли/ Спиридонов Н. А., Рачков А.К., Мухин С.А., Кондрашова М.Н.. // Бюл. №18. 27.06.1995
10. Lai J. C. K., Clark J. B. // Methods in Enzymology. 1979. Vol. 55. P. 51-59
11. Ohkava H. // Analytical Biochemistry. 1979. Vol. 95. P. 351-358
12. Kondrashova M. N. et al. // Mitochondrion. 2001. Vol. 1. P. 249-267
13. Litvinova, E.G. et al. // Proc. of the XI- th Biennal Meet. of the Society for Free Radical Research In-ternational.– Paris, France, 2002. P.93-96
14. Barrost M. et al. // J. Biol. Chem. 2004. Vol. 279. P. 49883-49888
15. Balaban R. S. et al. // Cell. 2005. Vol.120. P. 483-495